应用树莓优良品种奥瑞斯（Orus）进行组织培养技术的探索和研究，以期为其推广和大量繁育提供技术支撑。结果表明：（1）最佳外植体的选择为带芽茎段，最佳的取材时间为春季5月份，萌发率可达%。（2）最佳灭菌体系的流程为75%酒精浸泡30s后无菌水冲洗3～4次，然后以3%NaClO灭菌15min后无菌水冲洗3次。（3）奥瑞斯的最佳初代培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，最佳继代培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，增殖系数为4.55。最佳生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg·L-1，生根率为%，植株可平均生出3cm的根系3条。
树莓（RubusideausL.）果实有很高的营养价值，既是很好的鲜果食品，又可加工成果汁、果酒、果干蜜饯等食品。随着人们认识水平的不断提高，树莓将成为我国新兴果业的先锋树种，发展前景十分广阔。采用常规的营养繁殖方法无法在短时间内获得大量苗木，而组培快繁的方法具有更好的优势。通过树莓组织培养技术推动快速繁殖优良苗是一个重要的趋势，亟需建立一套完整的组织培养技术体系。目前虽然已有对树莓组织培养技术的研究，但针对优良品种奥瑞斯（Orus）的组培技术还未有涉及。通过对已有研究可知，不同种类树莓的最适生长条件不同，因此有必要针对奥瑞斯品种的快速繁殖优良苗进行组培技术研究。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料为引种于美国的优良树莓品种奥瑞斯（Orus），半匍匐型双季莓，果味佳，可鲜食，产量高。红莓果实柔软多汁，风味独特，色泽宜人。生长正常的植株于年4月从北京市房山区树莓生产基地移植至花盆内进行根蘖基质栽培。分别以带腋芽茎段、茎尖为外植体材料，从枝条上取2～5个带芽茎段（自茎尖下部开始，一般为单芽茎段），茎尖分别取自枝条顶端，然后将取下的外植体置于水中，移至试验室进行外植体接种试验。
1.2培养条件
组培室的培养条件为室温（25±2）℃，空气相对湿度60%左右，采用每日光照培养16h（6：00～22：00）和暗培养8h的光周期。每个培养架的光照由2根40W的直管型荧光灯管提供，强度为～lx。试验初代培养、继代培养都采用MS培养基，生根培养采用1/2MS培养基，并加入30g蔗糖作为碳源。
1.3试验方法
通过对已有相关文献的研究可知，不同品种树莓最适的培养条件不尽相同，传统的实验设计采用正交实验等设计方法；通过对比不同的研究成果可知，由于实验设计不同，涉及相同的培养基激素种类、浓度等培养因子较少，即使对同一品种树莓组织培养的最适体系仍存在结论不一的情况，即在不同的实验设计下出现多个“最适体系”。因此，本试验将已有研究中存在争议的结论作为不同水平的因子进行实验，从而探究奥瑞斯品种的最适培养体系。
1.3.1最佳外植体的选择
将单芽茎段、茎尖（外植体）置于流动水中冲洗0.5h，初步完成灭菌工作后置于超净工作台再次消毒（75%酒精30s，3%NaClO-15min）和剪切处理。将外植体接种于MS培养基上，30d后观察外植体生长势，通过外植体萌发率的比较，选出适合树莓组织培养的最佳外植体类型，其中萌发率（%）=萌发外植体数/接种总数×（式1）。将选出的外植体分别于5、6、8月取材和接种（继代培养），通过观察继代培养外植体的污染率和继代增殖系数，确定奥瑞斯组织培养的最佳取材时间，其中：污染率（%）=接种污染数/接种总数×（式2），增殖系数=每次继代切割所得带芽茎段数/原接种带芽茎段数（式3）。
1.3.2最佳灭菌条件的筛选
取健壮的带芽茎段、茎尖置于流动水中冲洗0.5h，再用75%酒精进行30s的初步灭菌（超净工作台），以灭菌剂NaClO的浓度、灭菌时间进行消毒试验。经过2%NaClO-15min、3%NaClO-15min、2%
NaClO-20min3种预处理后，将外植体接种于MS培养基中，7d后观察外植体污染情况并统计污染率、死亡率、成活率等，建立带芽茎段的最佳灭菌体系。每种处理接种20个外植体。
1.3.3初代培养基的筛选
在外植体处理和灭菌后，将带芽茎段接种到加有植物生长调节剂（6-BA、NAA、IAA）的MS培养基上（5个处理组合，表1），30d后统计增殖系数，进行Duncan0.05显著性检验，并结合外植体的萌发率、生长势等情况综合筛选出最佳的初代培养体系。每种处理组合接种20个外植体。
1.3.4继代培养基的筛选
将初代培养的试管苗剪成单芽茎段，接种时添加不同浓度的6-BA、NAA、IAA、GA的MS培养基（5个处理组合，见表2），每种处理重复20次，接种30d后调查增殖系数。诱导率（%）=诱导芽的外植体数/接种总数×（式4）。
1.3.5生根培养基的筛选将带芽茎段在初代培养（器官发生途径）下生成的试管苗接种到生根培养基上（共6个处理，见表3），30～40d后观察生根情况。每种处理接种20个带芽茎段。
2结果与分析
2.1最佳外植体的选择
2.1.1外植体类型的选择
将灭菌的树莓奥瑞斯带芽茎段、茎尖外植体分别接种于MS基本培养基上培养，带芽茎段的萌发率%＞茎尖萌发率13.3%，表明奥瑞斯在组织培养中带芽茎段应选为最佳外植体。
2.1.2最佳采集时间的确定
随着植物生长速度加快，原先的嫩枝条内不断木质化，在相同条件下的消毒效果都明显差异，5月、6月、8月的污染率分别为16.3%、23.5%、78%，呈显著增加的趋势；而增殖系数5月、6月、8月分别为7.49、8.00、5.19，呈先上升后下降趋势；综合污染率、增殖系数2个方面，外植体最佳取材时间为5月，此时污染率低，并且能基本维持较高的增殖系数，为之后的继代培养提供基础。
2.2最佳消毒灭菌条件
树莓消毒的NaClO浓度在2%～3%，消毒时间在15～20min，本研究经过2%NaClO-15min、3%NaClO-15min、2%NaClO-20min3种预处理后，发现2%NaClO-15min的处理污染率极高（淘汰），而3%NaClO-15min、2%NaClO-20min对芽体有一定的伤害作用，表现为个别腋芽生长势较差，因此不再设置更高浓度或更长时间的NaClO消毒，重点研究3%NaClO-15min、2%NaClO-20min的消毒灭菌作用。对于奥瑞斯品种，2种消毒处理的污染率分别为9.1%和23.8%，第一种3%NaC?lO-15min的消毒效果明显较优，奥瑞斯茎上有一定长度、软硬不同的枝刺，这在一定程度上影响了消毒效果。
2.3初代培养基的筛选
带芽茎段接种于分别加有6-BA、NAA、IAA、GA的5种初代培养基上培养，10d左右，叶芽迅速膨大萌发新叶，大部分外植体可以完成启动生长。在初代培养过程中，萌发率和植株生长势是最为重要的指标；其次为是否具有伸长生长，便于继代培养的操作；再次为增殖系数大小，增殖系数大的外植体通过继代培养，可达到更好的增殖效果。由表1可知，奥瑞斯品种初代培养基MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1（处理5）的增殖系数虽然不高（仅7.0），但其萌发率%且具有最好的生长势，所以最佳的初代培养基质应选处理5；IAA0.3mg·L-1以及NAA0.05mg·L-1时植株都呈明显的团状生长，增殖系数很高，但茎不伸长；将生长素浓度增至IAA0.5mg·L-1以及NAA0.1mg·L-1时则茎伸长、增殖系数有所降低，因此，在此范围内调整生长素浓度，可以得到较快伸长生长、增殖率高的愈伤组织。
树莓品种奥瑞斯的组培技术研究（附配方）时间：-08-:04:58点击：33次收藏
2.4继代培养基的筛选
初代培养的健壮植株在无菌条件下剪成单芽茎段，将带芽茎段接种于分别加有6-BA、NAA、IAA、GA的5种继代培养基上培养，10d左右后观察，继代单芽茎段的愈伤组织最大，并且继代培养的增殖系数较大（2.36～4.55）；综合考虑植株的增殖系数、生长势发现奥瑞斯的最佳继代培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+36NAA0.1mg·L-1（表2）。
2.5生根培养基的筛选
将经过初代和继代培养的壮苗接种（无菌条件）到分别加有NAA、IBA的1/2MS培养基中，经过40d左右，大多数植株产生愈伤组织，并开始生根，60d左右部分植株产生了主根和须根。调查生根率、根数量、长度、粗细等根系的指标，表明不同种类激素对植株生根的影响不同，奥瑞斯表现最佳为3号处理（IBA0.5mg·L-1，生根率%最高，根数量和根长都相对好），所以最佳生根培养基为MS+IBA0.5mg·L-1（表3）。
3结论与讨论
本实验选择树莓优良品种奥瑞斯作为试验材料，综合已有文献中由于实验设计不同带来的多种“最适条件”进行同种条件下比较，重点分析不同激素组合对培养效果的影响，确定了树莓奥瑞斯品种的组织培养技术方案。通过研究可知，不同树莓品种的最适组织培养条件不同，尤其是“红莓”、“黄莓”、“黑莓”等不同品系之间的差异；而多种激素组合都能达到增殖的效果，但效果存在差异。具体分析如下：
3.1最佳外植体的选择
以带芽茎段、茎尖2种外植体类型进行初代培养，结果表明树莓进行组织培养的最佳外植体类型为带芽茎段，从萌发率来看，带芽茎段（萌发率%）的效果明显优于茎尖（萌发率为13.3%），该结论与其他类似的研究基本一致；本次试验没有研究奥瑞斯品种单个腋芽的组织培养是否高于带芽茎段，树莓腋芽和顶芽的组织培养需要作进一步的研究。最佳外植体的最佳取材时间为春季5月，相比6、8月，5月外植体的污染率降低50%以上，增殖效果也较优。该结论与其他类似的研究中春季为最佳取材时间一致，与对比2、4、8、10月的最佳取材时间仅相差一个月，这可能是外植体的物候造成的，因此还需要进一步对组织分化程度、物候差异等因素进行研究。
3.2最佳灭菌体系的建立
以带芽茎段为外植体的初代培养，最佳的灭菌方法是以75%酒精浸泡30s，浸泡后无菌水冲洗3～4次，然后再以3%NaClO-15min，用无菌水冲洗3次。这样的消毒过程对植株伤害较小，灭菌较彻底，污染率仅为9.1%（低于2%NaClO-20min的23.8%的污染率）。随着植株的生长，树莓的组织培养消毒的效果差异较大，仅采用奥瑞斯为材料，试验结果的代表性还不够，与同类试验的灭菌体系0.5%NaClO-20min不同，这可能是品种、所取材料的发育程度等造成的，还需要作进一步的研究。
3.3初代培养体系的建立
以带芽茎段为外植体的初代培养，最佳的初代培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，萌发率为%，外植体伸长生长较好，苗的长势较强，便于进行下一步继代培养。试验设计未采用正交试验设计［14］，而是通过总结已有研究中的结论，对比出最优的不同激素组合及浓度。在本次试验中，对比了6-BA、6-BA+NAA、6-BA+IAA3种组合的作用，表明奥瑞斯适合6-BA+NAA组合。随着生长素类激素浓度的增加，对接种的植株的伸长促进作用明显，但是同时会降低植株的增殖情况，接种试验说明生长素类激素的使用对外植体愈伤组织的发育影响较大，一般使用范围为IAA0.3～0.5mg.L-1，NAA0.05～0.1mg.L-1。
3.4继代培养体系的建立
以带芽茎段为外植体的继代培养，最佳的继代培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，较高的增殖系数（4.55）对树莓继代培养有利，能为多代的继代培养提供基础。与初代培养一样，继代培养的试验设计也注重不同种类激素组合的不同效果比较，试验处理是已有研究中证实为最优的激素浓度，试验结果与相关研究有一定差异，可能是由于试验品种不同造成的差异。通过试验可知，6-BA、NAA的组合往往比加其他激素（如GA、IAA）的效果好，无论是生长素IAA还是赤霉素GA，促进植株伸长生长的作用都不明显，反而在一定程度上降低了增殖效果。奥瑞斯在细胞分裂素、生长素浓度同比例增加时，增殖系数先增高后降低，植株的生长势“先优后差”，说明植株的增殖情况不仅与细胞分裂素、生长素的比例相关，还与其浓度大小相关，在多代继代培养时，降低激素量的供应会引起植株的不适应。
3.5生根培养体系的建立
以带芽茎段为外植体的初代培养，最佳的生根培养基为MS+IBA0.5mg·L-1，生根率为%，植株可平均生出3cm的根系3条，在此条件下带芽茎段可以再生出较为健壮的根系。生根培养在试验设计时也总结了已有研究的成果，奥瑞斯的生根培养的最优处理与郭修武的结果一致，但与部分研究中的最佳处理为1、4、5不一致，这可能与品种、外植体材料的发育程度不同有关。奥瑞斯使用IBA进行生根培养的效果优于NAA，而仅用NAA与使用NAA+IBA组合的生根作用大体相似，因此仅使用IBA进行生根，不仅可以节约时间成本，而且提高了生根率，促进完整健壮的根系的形成。
赞赏
